1、PCR假阴性（扩增条带弱或无条带）

A 特征

● 仿品的目的条带不可能增加或条带弱；

● 阳性对照同样没有条带或条带极弱；

B  原因

● 目的片段条带过大导致扩增效率低；

● DNA模板质量较差或扩增体系不合适（扩增酶扩增效率不高或PCR程序不合适等）；

● PCR仪温控模块差异；

C  解决方式

● 设计备用引物，尽量缩短PCR产物大小；

● 使用试剂盒提取纯化DNA模板或优化鉴定体系（建议参照集萃ob电竞官网入口 推荐的程序进行鉴定）；

● 可尝试使用三步法PCR程序进行扩增，同时由于仪器、操作等环节依然存在变量，若上述处理无法改善，建议梯度测试最优退火温度。

2、PCR假阴性（泳道弥散状、伴随核酸挂孔或较严重的引物二聚体现象）

A  特征

● 胶孔大量发光，DNA无法脱离胶孔；

● 泳道出现弥散状抹带，通常伴随挂孔现象；

● 在胶图的最下方，常有比较明显的非目的条带；

B  原因

● DNA通过碱裂解、一步法试剂盒提取，未经纯化使用，蛋白裹在核酸上，导致核酸无法跑出胶孔；

● DNA模板附着较多杂质，影响引物的退火结合；

● 弥散的泳道通常为一些降解的核酸片段；

C  解决方式

● 重新纯化提取DNA或稀释DNA模板（降低杂质比例）；

● 更换备用引物或者使用高效率的扩增酶；

● 及时电泳，避免扩增产物长时间存放室温或4℃冰箱。

3、PCR假阳性（出现扩增污染）

A  特征

● 阴性对照、空白对照出现不符合预期的条带，通常会稍弱于阳性样品的主带，偶有与主带完全相同的亮度；

● 常发生于PCR产物小于500bp的反应中，产物越小，污染可能性越高；

B  原因

● 样品交叉污染，包括DNA模板、扩增体系配置或者电泳时污染；

● 气溶胶污染，少量样品鉴定时偶发，大批量样品鉴定、或者长时间使用同一对引物鉴定时发生频率明显增高；

C  解决方式

● 轻微污染时，提高退火温度、减少3-5循环、稀释DNA模板同时进行；

● 污染严重时，重新设计备用引物检测，条带不小于500bp，同时使用上述调整体系。

4、PCR特异性差（存在非特异性条带）

A  特征

除基本原则条带外，具有任何特异形测序的化合物，一直非特异形化合物与基本原则带相近，引响后果分辨；

B  原因

● 引物不特异；

● 酶的效率太强、退火温度偏低、退火延伸时间过长；

C  解决方式

● ;非特异性扩增条带较弱时，提高退火温度、减少3-5循环、稀释DNA模板同时进行，可有效抑制非特异性扩增；

● 非特异性扩增条带较强时（杂带亮度与目的带几乎一样或者更亮），重新设计PCR引物。

5、PCR优势扩增

A  特征

被检个体工商户存在杂合动态时，偶而会存在较纪录场面描写等位遗传基因测序生成物高出或少于较长场面描写测序生成物，或是会有块条带非常是没办法测序；

B  原因

● 当一个PCR反应中存在超过一种产物时，不同的产物会存在竞争性扩增，导致其中一种产物的产量远大于其他产物；

● 通常小条带比大条带更容易扩增，且两条带差距越大，优势扩增现象越明显；

● 个别情况下，比如产物序列存在特殊结构，也会出现大条带优势扩增现象；

C  解决方式

集萃ob电竞官网入口 签别情况报告为尽量尽量避免优劣势测序不干扰，平常两条线带贫富差距高出300bp，会分离设计制作引物用做检验，尽量尽量避免优劣势测序突然出现。

6、电泳条带弯曲

A  特征

电泳导致突然出现“微笑的表情状条带”；

B  原因

化学合成琼脂糖疑胶时，烧开尾部分所需的水分挥发，会造成琼脂糖疑胶中的电泳液溶液浓度值，低于电泳槽中的电泳液溶液浓度值。这时胶孔中的PCR化合物，重心部分渗透效率快，边上较近电泳液的化合物渗透效率慢，体流露出出造成的弯曲成；

C  解决方式

烧沸凝露后，须得增添蒸溜水，增加减压蒸馏的体积太，须得特别注意慢慢增添，并另外不光滑震动，禁止产品局部物理降温过快，导至凝露冷却塔不不光滑行成结团状。

7、实际电泳条带与目的带大小不符

A  特征

经由与Marker或一些照表相对比较，其实胶图上的主要目的带与评定预案中标单位记的货物面积有误；

B  原因

● 凝胶问题（质量较差、浓度较低）或者电泳时间不合适；

● Marker质量问题；

● 序列更新或标记的产物大小有偏差；

C  解决方式

● 调整凝胶浓度、电泳条件等条件（建议参照集萃ob电竞官网入口 推荐的电泳体系）；

● 更换合适品牌的Marker；

● 尝试使用备用引物。

在一致个PCR毛细现象保障体系中，存有2种或多种之上的PCR乙酰乙酸时，各种不同的乙酰乙酸测序转化率存有之间的关系，既得PCR的优劣势测序毛细现象（如同示1，乙酰乙酸②的测序转化率凸显优于乙酰乙酸①)。

示意图 1

表现形式：

当两类物质的GC含锌量将近、物质中间不存有特定节构且拓展时有足够时，小条带的PCRPCR扩增率要高于大条带的PCRPCR扩增率。

产生原因：

①因为Taq酶在老是的性质发生变化-固溶处理-延长过程中 中，酶的活性氧在不断降底（一般说来35-40反复后酶截然解离），而20-40反复中如今酶活的降底，大场面货物的延长生物富集利用率也大大的降底，而小场面的延长利用率受影响到较小，故PCR反复中，小场面货物的PCR扩增分量将欧亚于大场面的货物；②区域表现风险管理体系中，引物相对于范本开发的神经敏情绪化较低，若在PCR配置法的初始状态周期（前5-10配置法），现在已经行成了不少的小场面终生成物丰度，这么后继的配置法中，大部分数表现会以小场面的终生成物当作范本开发做好增加；超过两位重要因素堆叠，引起小段落终结果的含水量高远于大段落终结果的含水量（能达数据级的性别差异），故电泳时，小条带光亮度对比度将博大于等于大条带的光亮度对比度，甚至于是尚未测试到大条带的存在的。

优化方案：

将技术鉴定不一样的基因遗传型的症状，各是做出PCRPCR增加，即在设汁PCR设计时，挑选多种代谢物的炎症因子朋友核实设计（一般 确定世界最大条带为更好PCR增加条带，大条带无论能不能能不能PCR增加取得成功，犹豫的存在危险因素很大，不予确定操作）。的的调整预案：①根换产品更加的taq酶，让高循坏数时的酶活一定要稳定最 佳环境；②根换测序引物，一定要减少低循坏的乙酰乙酸聚集。

特殊情况：

在四种化合物的场面描写会有设备构造上的性别不一致性、或会有看不出的GC含铁区別时，优势增加的化合物将转变成GC匀、且不含有初中级设备构造的我依然化合物，此生产率虽然能够 所覆盖下列条带主产生的增加生产率性别不一致性。图甲示2如下图所示，化合物①的GC含铁匀，但化合物②的GC含铁特别高，所有只不过化合物②条带远少于化合物①,但增加生产率仍旧是化合物①更高些。

示意 2

什么是核酸气溶胶污染？

核酸气溶胶水风险， 即 DNA/RNA 气溶胶水风险，是检测室中极容易诞生的另外一种大气水风险。大气与夜体的液面滚动摩擦， 离心式式机离心式式，严重转动想法管， PCR 开盖，移液器一直吸样， 水风险物外泄等情况发生均会产生核酸气溶胶 。相似水风险的风险针对 PCR 检测结论尤其要偏态 ：极少量的核酸气溶胶水风险, 既能生成 PCR PCR扩增假阳型。 

气溶胶污染的表现形式：

● PCR 测试中， 以去铝离子水为模板下载的 PCR 副产物， 也可不可以扩张出原则条带， 在解决指标体系环境生态破坏 、试品间双向环境生态破坏的情况报告下， 时需人为会有气溶胶环境生态破坏；

● 由于此类污染的 PCR 扩增模板实际为游离的气溶胶核酸片段， 通常情况下为核酸碎 片 ， 且含量极低， 对于大片段的 PCR 扩增影响较小， 故通常出现在 PCR 产物大小在80-500bp 的 PCR 反应中。

气溶胶污染的预防及清理措施：

● 良好的实验习惯： PCR 实验前， 使用 75%乙醇， 进行桌面 、移液器的擦拭； 实验过程 中 ， DNA 提取 、 引物溶解 、 PCR 体系配置时，尽量避免剧烈震荡， EP 管的开关尽量轻柔，如发生样品飞溅时，及时使用 75%乙醇擦拭 2 次。

● 实验室环境控制 ：保持每天至少 4 个小时的通风， 尤其是冬夏开空调时期， 气溶胶污染高发。

● 当已经发现气溶胶污染时， 除了上述操作外， 我们会每天增加 8 小时的紫外照射， 并 开启实验室的负压通风装置， 由于气溶胶污染的顽固性， 通常 3 -4 周， 才可以完全清 除 。 而对于进行中的 PCR 实验， 我们建议在超净台/通风橱进行 PCR 实验， 开封新的试剂 、耗材（EP 管 、 引物 、酶 、 去离子水等） ， 由于气溶胶核酸片段不完整 、含量较 低， 所以提高 PCR 程序中的退火温度， 同时降低 3 -5 个循环， 效果也比较明显； 条件 允许时， 可以尝试更换 PCR 扩增区域， 将扩增片段控制在 800bp 左右， 也可以有效避免此类问题。